“La edición genética puede tener un impacto muy relevante en la conservación de los bosques autóctonos”

Elena Corredoira Castro, licenciada y doctora en Ciencias Biológicas por la Universidad de Santiago de Compostela, es científica titular del CSIC y responsable de la Unidad Técnica de Biotecnología y Mejora Forestal de la Misión Biológica de Galicia. Con una trayectoria de más de dos décadas en el cultivo in vitro, la embriogénesis somática y la modificación genética de especies leñosas, su grupo acaba de alcanzar un hito pionero: la primera edición genética de un gen de susceptibilidad en una especie forestal, el castaño europeo, mediante la técnica CRISPR/Cas9. Este avance, publicado en la revista Plant Stress, abre nuevas estrategias para enfrentar enfermedades como la tinta (Phytophthora cinnamomi) y el chancro (Cryphonectria parasitica), amenazas que se agravan con el cambio climático. A continuación, la investigadora gallega detalla los resultados, los desafíos técnicos y las implicaciones normativas y ambientales de este hallazgo.

– ¿Cuáles son las principales amenazas sanitarias que afectan al castaño en la actualidad y por qué se han agravado en los últimos años?
El castaño europeo está afectado principalmente por la enfermedad de la tinta, y el chancro y más recientemente la avispilla. Entre ellas destaca especialmente la tinta, causada principalmente por Phytophthora cinnamomi, y que puede llegar a provocar la muerte del árbol. En los últimos años, estas afecciones se han visto favorecidas por el cambio climático, ya que el aumento de las temperaturas y los periodos de lluvias intensas que alternan con largos periodos de sequía pueden debilitar los árboles y hacerlos más vulnerables a estos patógenos.

– ¿Qué es exactamente la edición genética con CRISPR/Cas9 y en qué se diferencia de las técnicas de mejora tradicional o de los transgénicos?
La edición genética mediante CRISPR/Cas9 es una herramienta de ingeniería genética que permite modificar de manera específica determinadas secuencias del ADN. A diferencia de la transgénesis clásica, en la que la inserción de material genético puede producirse de forma menos controlada en cuanto a su localización y número de copias, el sistema CRISPR/Cas9 permite dirigir la modificación hacia regiones concretas del genoma. Para ello, utiliza una molécula de ARN guía que dirige la proteína Cas9 hacia una secuencia específica de ADN, donde esta produce un corte. Posteriormente, los mecanismos naturales de reparación de la célula actúan sobre dicha región, permitiendo introducir modificaciones genéticas, como la eliminación, sustitución o incorporación de determinadas secuencias.

Esta enfermedad constituye una de las principales amenazas para la conservación y la productividad de los castaños

– ¿Por qué eligieron el castaño y el gen Cspmr4 para luchar contra la enfermedad de la tinta?
La elección del castaño europeo responde, por una parte, a la importancia ecológica, económica y cultural de esta especie forestal en nuestra comunidad y, por otra, a su elevada sensibilidad frente a la enfermedad de la tinta. Esta enfermedad constituye una de las principales amenazas para la conservación y productividad de los castañares, por lo que el desarrollo de nuevas estrategias biotecnológicas orientadas a incrementar la tolerancia del castaño frente a este patógeno resulta de especial interés.

La introducción o la sobreexpresión de genes se basa en reducir o eliminar la función de genes de susceptibilidad que el patógeno puede aprovechar para facilitar la infección o el desarrollo de la enfermedad.

Estos sistemas han permitido introducir genes relacionados con los mecanismos de defensa de las plantas, entre ellos genes que codifican proteínas PR (pathogenesis-related), como taumatinas y quitinasas, y una proteína tipo Ginkbilobina (Gnk2), cuya expresión se modifica en el castaño en respuesta a la infección por P. cinnamomi. Estos trabajos han permitido avanzar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la respuesta de las especies forestales frente a hongos y oomicetos y evaluar diferentes estrategias destinadas a incrementar su tolerancia. A partir de esta experiencia previa, se ha planteado una estrategia diferente basada en la edición genética mediante CRISPR/Cas9. Mientras que los trabajos anteriores se centraban principalmente en potenciar los mecanismos de defensa de la planta mediante la introducción o sobreexpresión de genes, la estrategia actual se basa en reducir o eliminar la función de genes de susceptibilidad (susceptibility genes o genes S), es decir, genes de la propia planta cuya actividad puede ser aprovechada por el patógeno para facilitar la infección o el desarrollo de la enfermedad.

Esta aproximación parte de investigaciones previas orientadas a comprender los mecanismos que permiten la entrada del patógeno en los tejidos vegetales, con el objetivo de identificar aquellos factores de la planta que resultan necesarios para que P. cinnamomi pueda infectar y colonizar el hospedador. Entre los genes identificados como candidatos de especial interés destaca PMR4, cuya función se ha relacionado con procesos que pueden influir en la susceptibilidad de la planta frente a determinados patógenos. Por ello, la modificación dirigida de este gen mediante CRISPR/Cas9 constituye una estrategia de interés para evaluar si su pérdida o reducción de función puede limitar la infección y, en consecuencia, aumentar la tolerancia del castaño frente a P. cinnamomi.

Se consigue conectar las dos etapas fundamentales del proceso: la edición específica del genoma y la regeneración de una planta a partir de las células modificadas.

– ¿Qué dificultades técnicas supone aplicar CRISPR/Cas9 en árboles y cómo las han superado?
Aunque la edición genética mediante CRISPR/Cas9 permite realizar modificaciones mucho más específicas y dirigidas que las técnicas de transformación genética convencional, su aplicación en especies forestales presenta importantes dificultades técnicas. Una de las principales limitaciones es que, al igual que ocurre con la transformación genética, no es suficiente con conseguir la edición de una célula vegetal: es imprescindible disponer de un sistema de regeneración eficiente que permita obtener una planta completa a partir de las células editadas. En este sentido, la embriogénesis somática es actualmente la herramienta más adecuada para la regeneración de plantas a partir de células transformadas o editadas. Sin embargo, su aplicación en especies leñosas es especialmente compleja, debido a que los árboles presentan una elevada dificultad para responder a las condiciones de cultivo in vitro y para regenerar plantas completas a partir de células o tejidos aislados.

En nuestro caso, una de las principales ventajas ha sido disponer de un sistema de embriogénesis somática previamente establecido y optimizado para el castaño. Este sistema permite obtener material embriogénico susceptible de ser editado mediante CRISPR/Cas9 y, posteriormente, regenerar plantas completas a partir de las células editadas. De esta manera, se consigue conectar las dos etapas fundamentales del proceso: la edición específica del genoma y la regeneración de una planta a partir de las células modificadas.

Por tanto, el principal reto no reside únicamente en conseguir una edición genética eficiente, sino en disponer de un protocolo de regeneración reproducible, estable y suficientemente eficaz que permita recuperar plantas completas a partir del material editado. La experiencia previa de nuestro grupo en embriogénesis somática y transformación genética en castaño ha sido, por ello, un elemento clave para abordar la aplicación de CRISPR/Cas9 en esta especie.

– ¿En qué consiste silenciar un gen de susceptibilidad y por qué es útil frente a Phytophthora cinnamomi?
Como he mencionado, previamente silenciar un gen de susceptibilidad consiste en reducir o impedir su expresión o su función con el objetivo de disminuir la capacidad de un patógeno para infectar o colonizar la planta. En nuestro caso, esta estrategia se ha planteado mediante CRISPR/Cas9, utilizando la edición genética para generar una pérdida o reducción de función del gen de susceptibilidad seleccionado. La utilidad de esta estrategia radica en que permite actuar sobre un mecanismo que el propio patógeno puede necesitar para completar con éxito la infección. Si la pérdida de función del gen reduce la susceptibilidad de la planta, podría conseguirse una mayor tolerancia frente a la enfermedad de la tinta sin necesidad de introducir material genético procedente de otra especie. Por ello, la edición de genes de susceptibilidad constituye una estrategia especialmente interesante para el desarrollo de nuevas variedades de castaño con una mayor capacidad de respuesta frente a P. cinnamomi.

– ¿Qué tipo de mutaciones han conseguido y qué ventaja tienen para la estabilidad de la tolerancia?
La edición genética se confirmó en cinco de las siete líneas embriogénicas obtenidas. En estas cinco líneas se obtuvo una eficiencia de edición de, al menos, un 97 % para una de las guías de ARN (gRNA) utilizadas, lo que demuestra una elevada eficacia del sistema CRISPR/Cas9 en el material embriogénico de castaño. Este elevado nivel de edición no solo se ha confirmado en las líneas embriogénicas, sino también en las plantas regeneradas a partir de dos de las líneas editadas que han conseguido germinar. Esta confirmación es especialmente relevante, ya que demuestra que las modificaciones introducidas mediante CRISPR/Cas9 se mantienen durante el proceso de regeneración y desarrollo de las plantas.

Los resultados obtenidos in vitro deben considerarse preliminares y requieren una posterior validación en condiciones más próximas a las naturales.

– ¿Qué limitaciones tiene probar la tolerancia solo en laboratorio y qué pasos siguen antes de ir al campo?
Los ensayos de tolerancia in vitro son una primera etapa fundamental para evaluar si las plantas editadas presentan una respuesta diferente frente a P. cinnamomi. Sin embargo, estos ensayos se realizan bajo condiciones controladas y simplificadas, que no reproducen completamente la complejidad de las condiciones naturales en las que se desarrolla la interacción entre el castaño y el oomiceto. Por este motivo, los resultados obtenidos in vitro deben considerarse preliminares y requieren una posterior validación en condiciones más próximas a las naturales. El siguiente paso es realizar ensayos ex vitro con plantas regeneradas a partir de las líneas editadas. Estos experimentos permiten comprobar si el comportamiento observado in vitro se mantiene en plantas aclimatadas ex vitro y si la modificación genética se traduce realmente en una mayor tolerancia frente a P. cinnamomi. Actualmente, como continuación de este trabajo, se están llevando a cabo estudios para evaluar la tolerancia de las plantas editadas en condiciones ex vitro.

– ¿Podría este mismo enfoque servir para proteger el castaño contra el chancro (Cryphonectria parasitica)?
Sí. La estrategia basada en la identificación y edición de genes de susceptibilidad mediante CRISPR/Cas9 podría ser aplicable también al chancro del castaño. De hecho, uno de los siguientes pasos de nuestro trabajo será evaluar la respuesta de las plantas de castaño editadas frente a C. parasitica. Esto permitirá determinar si las modificaciones genéticas obtenidas silenciando el gen PMR4, además de su posible efecto frente a P. cinnamomi, pueden conferir un mayor grado de tolerancia frente al chancro.

Esta estrategia puede tener un impacto muy relevante en la conservación de los bosques autóctonos, especialmente frente a enfermedades que están provocando una disminución importante de determinadas especies forestales.

– ¿Cómo encaja esta tecnología en la normativa europea sobre organismos modificados genéticamente?
Hasta ahora, las plantas obtenidas mediante CRISPR/Cas9 estaban sometidas en la Unión Europea a la normativa sobre organismos modificados genéticamente (OMG), lo que suponía una importante limitación para su aplicación práctica. Sin embargo, la normativa europea está evolucionando con la regulación de las nuevas técnicas genómicas (NGT). Las nuevas normas, que serán aplicables a partir de julio de 2028, establecen una diferenciación entre plantas con modificaciones genéticas equivalentes a las que podrían obtenerse mediante mejora convencional y aquellas con modificaciones más complejas. En nuestro caso, la edición de un gen de susceptibilidad como PMR4 mediante CRISPR/Cas9, sin introducir material genético de otras especies, podría beneficiarse de este nuevo marco regulatorio. No obstante, la utilización de CRISPR/Cas9 no determina por sí misma la clasificación regulatoria, que dependerá de las características concretas de la planta obtenida y de los criterios establecidos por la normativa europea. Este cambio legislativo podría facilitar en el futuro la aplicación de la edición genética para desarrollar castaños más tolerantes frente a enfermedades como la enfermedad de la tinta.

¿Qué impacto puede tener esta estrategia en la conservación de los bosques autóctonos y en su diversidad?
Esta estrategia puede tener un impacto muy relevante en la conservación de los bosques autóctonos, especialmente frente a enfermedades que están provocando una disminución importante de determinadas especies forestales. El desarrollo de plantas con una mayor tolerancia frente a patógenos como P. cinnamomi podría contribuir a reducir la mortalidad de los árboles, favorecer su regeneración natural y mantener las poblaciones de especies de gran valor ecológico, como el castaño y otras como el alcornoque o la encina.

– ¿Cuánto tiempo puede pasar hasta que haya variedades comerciales disponibles y qué hitos faltan?
Todavía es prematuro establecer un plazo concreto para disponer de variedades comerciales, ya que antes deben superarse varias etapas experimentales y regulatorias. En primer lugar, es necesario confirmar en condiciones ex vitro que las plantas editadas presentan una mayor tolerancia frente a P. cinnamomi y comprobar que este carácter es estable. Además, debemos optimizar las estrategias de selección y regeneración para evitar, en la medida de lo posible, el empleo de genes marcadores de selección basados en genes de resistencia a antibióticos, como la kanamicina, y avanzar hacia la obtención de plantas editadas libres de estos elementos. Por último, será necesario cumplir con los requisitos regulatorios europeos aplicables a las plantas obtenidas mediante nuevas técnicas genómicas. Por tanto, aunque los resultados actuales son prometedores, la obtención de una variedad comercial requerirá todavía varios años de investigación, validación y evaluación regulatoria.

Los resultados obtenidos en castaño pueden constituir un punto de partida para desarrollar estrategias de edición genética aplicables a otras especies forestales amenazadas

– ¿Qué supone este hallazgo para el futuro de la edición genética en otras especies forestales amenazadas?
Esta misma estrategia ya la estamos evaluando en encina, una especie de gran importancia ecológica que se encuentra también seriamente afectada por P. cinnamomi. El objetivo es determinar si la edición de genes de susceptibilidad puede contribuir a aumentar la tolerancia de la encina frente a este patógeno. Por tanto, los resultados obtenidos en castaño pueden constituir un punto de partida para desarrollar estrategias de edición genética aplicables a otras especies forestales amenazadas, contribuyendo a la conservación de especies de gran valor ecológico y a la protección de nuestros ecosistemas forestales.