“A edición xenética pode ter un impacto moi relevante na conservación dos bosques autóctonos”

rpt

Elena Corredoira Castro, licenciada e doutora en Ciencias Biolóxicas pola Universidade de Santiago de Compostela, é científica titular do CSIC e responsable da Unidade Técnica de Biotecnoloxía e Mellora Forestal da Misión Biolóxica de Galicia. Cunha traxectoria de máis de dúas décadas no cultivo in vitro, na embrioxénese somática e na modificación xenética de especies leñosas, o seu grupo acaba de acadar un fito pioneiro: a primeira edición xenética dun xene de susceptibilidade nunha especie forestal, o castiñeiro europeo, mediante a técnica CRISPR/Cas9. Este avance, publicado na revista Plant Stress, abre novas estratexias para enfrontar enfermidades como a tinta (Phytophthora cinnamomi) e o cancro (Cryphonectria parasitica), ameazas que se agravan co cambio climático. A continuación, a investigadora galega detalla os resultados, os desafíos técnicos e as implicacións normativas e ambientais deste achado.

– Cales son as principais ameazas sanitarias que afectan o castiñeiro na actualidade e por que se agravaron nos últimos anos?
O castiñeiro europeo está afectado principalmente pola enfermidade da tinta, o cancro e, máis recentemente, a avespilla. Entre elas destaca especialmente a tinta, causada principalmente por Phytophthora cinnamomi, que pode chegar a provocar a morte da árbore. Nos últimos anos, estas afeccións víronse favorecidas polo cambio climático, xa que o aumento das temperaturas e os períodos de choivas intensas que alternan con longos períodos de seca poden debilitar as árbores e facelas máis vulnerables a estes patóxenos.

– Que é exactamente a edición xenética con CRISPR/Cas9 e en que se diferencia das técnicas de mellora tradicional ou dos transxénicos?
A edición xenética mediante CRISPR/Cas9 é unha ferramenta de enxeñaría xenética que permite modificar de maneira específica determinadas secuencias do ADN. A diferenza da transxénese clásica, na que a inserción de material xenético pode producirse de forma menos controlada canto á súa localización e número de copias, o sistema CRISPR/Cas9 permite dirixir a modificación cara a rexións concretas do xenoma. Para iso, utiliza unha molécula de ARN guía que dirixe a proteína Cas9 cara a unha secuencia específica de ADN, onde esta produce un corte. Posteriormente, os mecanismos naturais de reparación da célula actúan sobre esa rexión, o que permite introducir modificacións xenéticas, como a eliminación, a substitución ou a incorporación de determinadas secuencias.

Esta enfermidade constitúe unha das principais ameazas para a conservación e a produtividade dos castiñeiros

– Por que elixiron o castiñeiro e o xene Cspmr4 para loitar contra a enfermidade da tinta?
A elección do castiñeiro europeo responde, por unha parte, á importancia ecolóxica, económica e cultural desta especie forestal na nosa comunidade e, por outra, á súa elevada sensibilidade fronte á enfermidade da tinta. Esta enfermidade constitúe unha das principais ameazas para a conservación e a produtividade dos castiñeiros, polo que o desenvolvemento de novas estratexias biotecnolóxicas orientadas a incrementar a tolerancia do castiñeiro fronte a este patóxeno resulta de especial interese. O noso grupo de investigación foi pioneiro no desenvolvemento de sistemas de transformación xenética clásica en castiñeiro, así como noutras especies forestais de interese, como o carballo, a aciñeira e a sobreira.

A introdución ou a sobreexpresión de xenes baséase en reducir ou eliminar a función de xenes de susceptibilidade que o patóxeno pode aproveitar para facilitar a infección ou o desenvolvemento da enfermidade.

Estes sistemas permitiron introducir xenes relacionados cos mecanismos de defensa das plantas, entre eles xenes que codifican proteínas PR (pathogenesis-related), como taumatinas e quitinasas, e unha proteína tipo Ginkbilobina (Gnk2), que modifica a súa expresión no castiñeiro en resposta á infección por P. cinnamomi. Estes traballos permitiron avanzar no coñecemento dos mecanismos implicados na resposta das especies forestais fronte a fungos e oomicetos e avaliar diferentes estratexias destinadas a incrementar a súa tolerancia. A partir desta experiencia previa, expúxose unha estratexia diferente baseada na edición xenética mediante CRISPR/Cas9. Mentres que os traballos anteriores se centraban principalmente en potenciar os mecanismos de defensa da planta mediante a introdución ou a sobreexpresión de xenes, a estratexia actual baséase en reducir ou eliminar a función de xenes de susceptibilidade (susceptibility genes ou xenes S), isto é, xenes da propia planta que o patóxeno pode aproveitar para facilitar a infección ou o desenvolvemento da enfermidade.

Esta aproximación parte de investigacións previas orientadas a comprender os mecanismos que permiten a entrada do patóxeno nos tecidos vexetais, co obxectivo de identificar aqueles factores da planta que resultan necesarios para que P. cinnamomi poida infectar e colonizar o hóspede. Entre os xenes identificados como candidatos de especial interese destaca PMR4, que se relacionou con procesos que poden influír na susceptibilidade da planta fronte a determinados patóxenos. Por iso, a modificación dirixida deste xene mediante CRISPR/Cas9 constitúe unha estratexia de interese para avaliar se a súa perda ou redución de función pode limitar a infección e, en consecuencia, aumentar a tolerancia do castiñeiro fronte a P. cinnamomi.

Conséguese conectar as dúas etapas fundamentais do proceso: a edición específica do xenoma e a rexeneración dunha planta a partir das células modificadas.

– Que dificultades técnicas supón aplicar CRISPR/Cas9 en árbores e como as superaron?
Aínda que a edición xenética mediante CRISPR/Cas9 permite realizar modificacións moito máis específicas e dirixidas que as técnicas de transformación xenética convencional, a súa aplicación en especies forestais presenta importantes dificultades técnicas. Unha das principais limitacións é que, do mesmo xeito que ocorre coa transformación xenética, non abonda con conseguir a edición dunha célula vexetal: é imprescindible dispor dun sistema de rexeneración eficiente que permita obter unha planta completa a partir das células editadas. Neste sentido, a embrioxénese somática é actualmente a ferramenta máis axeitada para a rexeneración de plantas a partir de células transformadas ou editadas. Porén, a súa aplicación en especies leñosas é especialmente complexa, debido a que as árbores presentan unha elevada dificultade para responder ás condicións de cultivo in vitro e para rexenerar plantas completas a partir de células ou tecidos illados. No noso caso, unha das principais vantaxes foi dispor dun sistema de embrioxénese somática previamente establecido e optimizado para o castiñeiro.

Este sistema permite obter material embrioxénico susceptible de ser editado mediante CRISPR/Cas9 e, posteriormente, rexenerar plantas completas a partir das células editadas. Deste xeito, conséguese conectar as dúas etapas fundamentais do proceso: a edición específica do xenoma e a rexeneración dunha planta a partir das células modificadas. Polo tanto, o principal reto non reside unicamente en conseguir unha edición xenética eficiente, senón en dispor dun protocolo de rexeneración reproducible, estábel e suficientemente eficaz que permita recuperar plantas completas a partir do material editado. A experiencia previa do noso grupo en embrioxénese somática e en transformación xenética en castiñeiro foi, por iso, un elemento clave para abordar a aplicación de CRISPR/Cas9 nesta especie.

– En que consiste silenciar un xene de susceptibilidade e por que é útil fronte a Phytophthora cinnamomi?
Como mencionei previamente, silenciar un xene de susceptibilidade consiste en reducir ou impedir a súa expresión ou a súa función co obxectivo de diminuír a capacidade dun patóxeno para infectar ou colonizar a planta. No noso caso, esta estratexia expúxose mediante CRISPR/Cas9, utilizando a edición xenética para xerar unha perda ou redución de función do xene de susceptibilidade seleccionado. A utilidade desta estratexia radica en que permite actuar sobre un mecanismo que o propio patóxeno pode necesitar para completar con éxito a infección. Se a perda de función do xene reduce a susceptibilidade da planta, podería conseguirse unha maior tolerancia fronte á enfermidade da tinta sen necesidade de introducir material xenético procedente doutra especie. Por iso, a edición de xenes de susceptibilidade constitúe unha estratexia especialmente interesante para o desenvolvemento de novas variedades de castiñeiro cunha maior capacidade de resposta fronte a P. cinnamomi.

– Que tipo de mutacións conseguiron e que vantaxe teñen para a estabilidade da tolerancia?
A edición xenética confirmouse en cinco das sete liñas embrioxénicas obtidas. Nestas cinco liñas obtívose unha eficiencia de edición de, polo menos, o 97 % para unha das guías de ARN (gRNA) utilizadas, o que demostra unha elevada eficacia do sistema CRISPR/Cas9 no material embrioxénico de castiñeiro. Este elevado nivel de edición non só se confirmou nas liñas embrioxénicas, senón tamén nas plantas rexeneradas a partir de dúas das liñas editadas que conseguiron xerminar. Esta confirmación é especialmente relevante, xa que demostra que as modificacións introducidas mediante CRISPR/Cas9 se manteñen durante o proceso de rexeneración e desenvolvemento das plantas.

Os resultados obtidos in vitro deben considerarse preliminares e requiren unha posterior validación en condicións máis próximas ás naturais.

– Que limitacións ten probar a tolerancia só en laboratorio e que pasos seguen antes de ir ao campo?
Os ensaios de tolerancia in vitro son unha primeira etapa fundamental para avaliar se as plantas editadas presentan unha resposta diferente fronte a P. cinnamomi. Porén, estes ensaios realízanse baixo condicións controladas e simplificadas, que non reproducen completamente a complexidade das condicións naturais nas que se desenvolve a interacción entre o castiñeiro e o oomiceto. Por este motivo, os resultados obtidos in vitro deben considerarse preliminares e requiren unha posterior validación en condicións máis próximas ás naturais. O seguinte paso é realizar ensaios ex vitro con plantas rexeneradas a partir das liñas editadas. Estes experimentos permiten comprobar se o comportamento observado in vitro se mantén en plantas aclimatadas ex vitro e se a modificación xenética se traduce realmente nunha maior tolerancia fronte a P. cinnamomi. Actualmente, como continuación deste traballo, están a realizarse estudos para avaliar a tolerancia das plantas editadas en condicións ex vitro.

– Podería este mesmo enfoque servir para protexer o castiñeiro contra o cancro (Cryphonectria parasitica)?
Si. A estratexia baseada na identificación e edición de xenes de susceptibilidade mediante CRISPR/Cas9 podería ser aplicábel tamén ao cancro do castiñeiro. De feito, un dos seguintes pasos do noso traballo será avaliar a resposta das plantas de castiñeiro editadas fronte a C. parasitica. Isto permitirá determinar se as modificacións xenéticas obtidas ao silenciar o xene PMR4, ademais do seu posible efecto fronte a P. cinnamomi, poden conferir un maior grao de tolerancia fronte ao cancro.

Esta estratexia pode ter un impacto moi relevante na conservación dos bosques autóctonos, especialmente fronte a enfermidades que están a provocar unha diminución importante de determinadas especies forestais.

Como encaixa esta tecnoloxía na normativa europea sobre organismos modificados xeneticamente?
Ata agora, as plantas obtidas mediante CRISPR/Cas9 estaban sometidas na Unión Europea á normativa sobre organismos modificados xeneticamente (OMG), o que supoñía unha importante limitación para a súa aplicación práctica. Porén, a normativa europea está a evolucionar coa regulación das novas técnicas xenómicas (NGT). As novas normas, que serán aplicábeis a partir de xullo de 2028, establecen unha diferenciación entre plantas con modificacións xenéticas equivalentes ás que poderían obterse mediante mellora convencional e aquelas con modificacións máis complexas. No noso caso, a edición dun xene de susceptibilidade como PMR4 mediante CRISPR/Cas9, sen introducir material xenético doutras especies, podería beneficiarse deste novo marco regulatorio. Non obstante, a utilización de CRISPR/Cas9 non determina por si mesma a clasificación regulatoria, que dependerá das características concretas da planta obtida e dos criterios establecidos pola normativa europea. Este cambio lexislativo podería facilitar no futuro a aplicación da edición xenética para desenvolver castiñeiros máis tolerantes fronte a enfermidades como a tinta.

– Que impacto pode ter esta estratexia na conservación dos bosques autóctonos e na súa diversidade?
Esta estratexia pode ter un impacto moi relevante na conservación dos bosques autóctonos, especialmente fronte a enfermidades que están a provocar unha diminución importante de determinadas especies forestais. O desenvolvemento de plantas cunha maior tolerancia fronte a patóxenos como P. cinnamomi podería contribuír a reducir a mortalidade das árbores, favorecer a súa rexeneración natural e manter as poboacións de especies de gran valor ecolóxico, como o castiñeiro e outras como a sobreira ou a aciñeira.

– Canto tempo pode pasar ata que haxa variedades comerciais dispoñibles e que fitos faltan?
Aínda é prematuro establecer un prazo concreto para dispor de variedades comerciais, xa que antes deben superarse varias etapas experimentais e regulatorias. En primeiro lugar, é necesario confirmar en condicións ex vitro que as plantas editadas presentan unha maior tolerancia fronte a P. cinnamomi e comprobar que este carácter é estábel. Ademais, debemos optimizar as estratexias de selección e rexeneración para evitar, na medida do posible, o emprego de xenes marcadores de selección baseados en xenes de resistencia a antibióticos, como a canamicina, e avanzar cara á obtención de plantas editadas libres destes elementos. Por último, será necesario cumprir os requisitos regulatorios europeos aplicábeis ás plantas obtidas mediante novas técnicas xenómicas. Polo tanto, aínda que os resultados actuais son prometedores, a obtención dunha variedade comercial requirirá aínda varios anos de investigación, validación e avaliación regulatoria.

Os resultados obtidos en castiñeiro poden constituír un punto de partida para desenvolver estratexias de edición xenética aplicábeis a outras especies forestais ameazadas

– Que supón este achado para o futuro da edición xenética noutras especies forestais ameazadas?
Esta mesma estratexia xa a estamos avaliar na aciñeira, unha especie de gran importancia ecolóxica que se atopa tamén seriamente afectada por P. cinnamomi. O obxectivo é determinar se a edición de xenes de susceptibilidade pode contribuír a aumentar a tolerancia da aciñeira fronte a este patóxeno. Polo tanto, os resultados obtidos en castiñeiro poden constituír un punto de partida para desenvolver estratexias de edición xenética aplicábeis a outras especies forestais ameazadas, contribuíndo á conservación de especies de gran valor ecolóxico e á protección dos nosos ecosistemas forestais.